Unser Projekt

Die steigende Konzentration des Treibhausgases Kohlenstoffdioxid (CO2) in der Atmosphäre stellt ein wachsendes Problem dar. Um diesem zu begegnen, muss nicht nur der aktuelle CO2-Ausstoß verringert, sondern auch das vorhandene CO2in biologischem Material gebunden werden. Natürlicherweise erfolgt dies beispielsweise durch Pflanzen oder Cyanobakterien, welche Lichtenergie für die F-Fixierung verwenden. Aktuell werden Ansätze zur unterirdischen Speicherung des Gases erforscht, um eine weitere Akkumulation in der Atmosphäre zu vermeiden. Die Nachhaltigkeit dieses als „Carbon Capture and Storage“ (CCS) bezeichneten Verfahrens ist jedoch umstritten.
In unserem Projekt wollen wir das Gram-negative Darmbakterium Escherichia coli verwenden. Die zur CO2-Fixierung und für das Wachstum der Zellen benötigte Energie soll aus überschüssigem Strom gewonnen werden. Gegenwärtig werden in Deutschland Anlagen zur nachhaltigen Gewinnung von Strom gebaut, ohne dass eine entsprechende Infrastruktur zum Transport des Stroms existiert. Wir möchten den Strom daher vor Ort für eine „elektroautotrophe“ Herstellung von biotechnologischen Produkten (z.B. Isobutanol) verwenden.
Wir planen die Entwicklung von drei separat verwendbaren Modulen:

  • Im ersten Modul wird Energie von einer Elektrode auf die Zellen übertragen.
  • Das zweite Modul dient der Fixierung von atmosphärischem Kohlenstoffdioxid.
  • Abschließend werden durch das dritte Modul Produkte (z.B. Isobutanol) hergestellt.
 

Diese Modularisierung soll sowohl die separate Verwendung für andere Projekte als auch eine schnelle Adaptation der Produktion an aktuelle Bedürfnisse ermöglichen.

Modul I

Für die CO2-Fixierung wird neben Energie in Form von ATP auch eine reduzierte Substanz (z.B. NAD(P)H) benötigt, denn die Reduktion von CO2 geht mit der Oxidation von NAD(P)H einher. Die Versorgung der Zellen mit Reduktionsäquivalenten (NAD(P)H) erfolgt über eine „reverse mikrobielle Brennstoffzelle“ (rMFC). Dabei handelt es sich um ein System, das Strom verbraucht, um zunächst reduzierte Substanzen und letztlich Biomasse oder andere Produkte zu erzeugen. Die Anode und Kathode sind durch eine Kationenaustauschmembran voneinander getrennt. Inder Anodenkammer findet Wasserspaltung statt. Die dabei entstehenden Protonen gelangen aufgrund des Ladungsausgleichs über die Membran in den Kathodenraum. An der Kathode würde bei einer Elektrolyse durch Reduktion der Protonen Wasserstoff entstehen (Larminie, 2003). In der rMFC soll diese Reaktion unterbunden werden, indem die Elektronen direkt auf einen Mediator übertragen werden. Dieser Mediator wird an der Elektrode reduziert und anschließend von den Bakterienzellen aufgenommen. Innerhalb der Zellen wird der Mediator oxidiert, indem die Elektronen direkt oder indirekt auf NAD(P)+ übertragen werden. Anschließend wird der oxidierte Mediator für eine erneute Reduktion an der Elektrode aus der Zelle exportiert. Als Mediator sind sowohl chemische Substanzen,als auch organische Moleküle denkbar. Die Verwendung eines chemischen Mediators besitzt den Vorteil, dass die Elektronen effektiv von der Kathode auf den Mediator übertragen werden können. Erforderlich ist jedoch zudem die schnelleAufnahme des chemischen, zellfremden Mediators durch die Bakterien. Bei Verwendung von organischen Molekülen besteht die Möglichkeit, dass diese von der Zelle aufgenommen, in ihren Stoffwechsel eingeschleust und somit nicht wieder abgegeben werden. Dies trifft vor allem auf Intermediate der Glykolyse zu. Auch die Oxidation des Mediators in der Zelle und der anschließende Export des oxidierten Mediators sind essentiell für die Funktionalität des Systems. Hier bieten organische Moleküle den Vorteil, dass entsprechende Enzyme existieren, welche die Oxidation gewährleisten. Für chemische Mediatoren hingegen existieren zumeist keine natürlichen Enzyme und Transporter.

Modul II

Das in der Zelle hergestellte NAD(P)H kann durch die Atmungskette wieder zu NAD(P)+ oxidiert werden. Dabei wird ein Protonengradient über der Cytoplasmamembran aufgebaut, welcher im nächsten Schritt für die ATP-Synthese verwendet wird. Mittels der so gewonnenen Reduktions- und Energieäquivalenten sollen die Zellen CO2 fixieren und als Kohlenstoffquelle nutzen können. Wir diskutieren dafür gegenwärtig zwei mögliche Wege, die im Folgenden dargestellt werden.
Bei beiden Wegen wird die Herstellung von Pyruvat angestrebt, welches als Schnittstelle zu den darauffolgenden Biosynthesewegen dienen kann.
Der erste Weg beinhaltet die Expression von Genen, die für ein Carboxysom inklusive Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase-Oxigenase (RubisCO) aus Halothiobacillus neapolitanus (Bonacci et al., 2012) kodieren. Das Ziel ist die Konstruktion eines modifizierten Calvin-Benson-Zyklus in E.coli. Aufgrund der großen evolutionären Distanz von E.coli und H.neopolitanusmüssen die kodierenden Sequenzen an das Codon-Usage von E.coli angepasst werden. Neben dem Carboxysom als der zentralen Komponente fehlen E.coli zwei weitere Enzyme: Phosphoribulokinase (PRKa) und Sedoheptulose-1,7-bisphosphatase (SBPase). Wir möchten dafür Enzyme aus Synechococcus elongatus bzw. Bacillus methanolicus verwenden (Bonacci et al., 2012; Stolzenberger et al., 2013).
Eine Alternative zum Carboxysom mit der RubisCO ist der 3-Hydroxy-Propionat-Weg, der bereits in E.coli untersucht wurde (Mattozzi et al., 2013). Bei diesem ist jedoch ebenfalls eine Optimierung erforderlich, da bisher noch kein Zusammenspiel aller Komponenten gezeigt werden konnte.

Modul III

Wir möchten den gewonnenen Kohlenstoff verwenden, um biotechnologische Produkte herzustellen. Zur Demonstration der Funktionalität unseres Systems streben wir zunächst die Herstellung von Isobutanol an. Als Grundlage dienen ein System, das von Atsumi entwickelt wurde (Atsumi et al., 2008), sowie die iGEM-Projekte von den Formosa-Teams 2011 und 2012. Außerdem sondieren wir Möglichkeiten zur Herstellung von Terpenen, Putrescin, L-Homoalanin und weiteren vielversprechenden Produkten.

Referenzen

  • Atsumi, S., Hanai, T., and Liao, J.C. (2008). Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols as biofuels. Nature 451, 86–89. Bonacci, W., Teng, P.K., Afonso, B., Niederholtmeyer, H., Grob, P., Silver, P.A., and Savage,D.F. (2012). Modularity of a carbon-fixing protein organelle. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 478–483.
  • Mattozzi, M. d, Ziesack, M., Voges, M.J., Silver, P.A., and Way, J.C. (2013). Expression of the sub-pathways of the Chloroflexus aurantiacus 3-hydroxypropionate carbon fixation bicycle in E. coli: Toward horizontal transfer of autotrophic growth. Metab. Eng. 16, 130–139.
  • Stolzenberger, J., Lindner, S.N., Persicke, M., Brautaset, T., and Wendisch, V.F. (2013). Characterization of fructose 1,6-bisphosphatase and sedoheptulose 1,7-bisphosphatase from the facultative ribulose monophosphate cycle methylotroph Bacillus methanolicus. J. Bacteriol.